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馬齒莧功能飲料專利，一種馬齒莧功能飲料及其制備方法

申請號為201510741297.1、名稱為“一種馬齒莧功能飲料及其制備方法”的分案申請。

技術領域 本發明屬于植物飲料制備技術領域，具體涉及一種馬齒莧功能飲料及其制備方法。

背景技術 目前國內市場的馬齒莧(拉丁學名：

Portulaca oleracea L。)功能飲料尚未見于銷售，但見諸網絡、雜志甚至專利申請的很多，且大部分屬于一般性功能飲料，其方法主要是在100℃的高溫下，用水提取馬齒莧本身的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、馬齒莧多糖等有效成分，但是由于其提取溫度較高，從而造成有效成分的破壞和流失，而且在存放的過程中容易變質。

中國專利申請“馬齒莧飲料及其制備方法”(申請號：200410066930.3)中，公開的馬齒莧飲料的原料中含有馬齒莧的水浸泡汁、蜂蜜、白糖、醋、檸檬酸；馬齒莧的水浸泡汁是采用35-45℃的溫水浸泡獲得。

該馬齒莧飲料雖然的制備中無需高溫加熱，但制備方法過于粗放，其中的活性成分易變質，穩定性差，保質期較短，所以保健作用極其有限。

所以，市場上需要研發出一種配料合理、制備方法合適且簡便、有效成分保存完成的馬齒莧飲料。

發明內容 本發明的目的在于提供一種馬齒莧功能飲料及其制備方法，該飲料的原料包括馬齒莧、葉酸、維生素C、檸檬酸、果膠酶、殼聚糖等，具有增強免疫力、抗衰老的作用，采用低溫、生物提取技術，在配方中添加葉酸和維生素C抗氧化成分，與原有的不飽和脂肪酸結合形成新的絡合產物，能較好地保留馬齒莧的有效成分。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種馬齒莧功能飲料，所述馬齒莧功能飲料包括以下重量份數比的原料：

上述馬齒莧功能飲料，作為一種優選實施方式，所述水為純凈水。

上述馬齒莧功能飲料，作為一種優選實施方式，還包括以下重量份數比的原料：

甜味劑 2-15。

上述馬齒莧功能飲料，作為一種優選實施方式，原料中還包括甜味劑，所述甜味劑為甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸鉀中的一種或幾種的組合；優先地，所述甜味劑為甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸鉀，且甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸鉀之間的重量份數比為：

(0.5-2)：

(0.5-2)：

(1-10)：

(1-10)。

上述馬齒莧功能飲料，作為一種優選實施方式，還包括以下重量份數比的原料：

糖 10-5000。

優選地，所述糖為蔗糖。

本發明中的原料具有如下功效：

(1)馬齒莧：

含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、膳食纖維、鈣、磷、鐵、銅、胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2、尼克酸、維生素C等多種營養成分，尤其是維生素A、維生素C、核黃素等維生素和鈣、鐵等礦物質。

其ω-3脂肪酸含量在綠葉菜中占首位。

具有重要的藥用價值：

清熱解毒，散血消腫；治熱痢膿血，熱淋，血淋，帶下，癰腫惡瘡，丹毒，痕疬。

用于濕熱所致的腹瀉、痢疾，常配黃連、木香；內服或搗汁外敷，治癰腫。

亦用于便血、子宮出血，有止血作用。

還具有利水、消腫、降低血壓的功能，馬齒莧含有大量的鉀鹽，有良好的利水消腫作用；鉀離子還可直接作用于血管壁上，使血管壁擴張，阻止動脈管壁增厚，從而起到降低血壓的作用。

馬齒莧能消除塵毒，防止吞噬細胞變性和壞死，還可以防止淋巴管發炎和阻止纖維性變化，杜絕矽結節形成，對白癜風也有一定的療效。

馬齒覺還含有較多的胡蘿卜素，能促進潰瘍病的愈合。

馬齒莧對痢疾桿菌、傷寒桿菌和大腸桿菌有較強的抑制作用，可用于各種炎癥的輔助治療，素有“天然抗生素”之稱。

馬齒莧中含有一種豐富的Y－3脂肪酸，它能抑制人體內血清膽固醇和甘油三酯酸的生成，幫助血管內皮細胞合成的前列腺素增多，抑制血小板形成血栓素A2，使血液粘度下降，促使血管擴張，可以預防血小板聚集、冠狀動脈痙攣和血栓形成，從而起到防治心臟病的作用。

(2)葉酸：

是一種水溶性維生素，葉酸最重要的功能就是制造紅血球和白血球，增強免疫能力，對嬰幼兒的神經細胞與腦細胞發育有促進作用，輔助治療精神分裂癥，預防貧血，胎兒成長所必須的維生素，保護胃腸黏膜。

(3)維生素C：

預防動脈硬化：

可促進膽固醇的排泄，防止膽固醇在動脈內壁沉積，甚至可以使沉積的粥樣斑塊溶解。

抗氧化劑：

可以保護其它抗氧化劑，如維生素A、維生素E、不飽和脂肪酸，防止自由基對人體的傷害。

治療貧血：

使難以吸收利用的三價鐵還原成二價鐵，促進腸道對鐵的吸收，提高肝臟對鐵的利用率，有助于治療缺鐵性貧血。

防癌：

豐富的膠原蛋白有助于防止癌細胞的擴散；VC的抗氧化作用可以抵御自由基對細胞的傷害防止細胞的變異；阻斷亞硝酸鹽和仲胺形成強致癌物亞硝胺。

(4)檸檬酸：

起到了抗氧化劑的作用，能夠延長本發明的保質期。

(5)果膠酶：

外觀呈淺黃色粉末狀。

果膠酶主要用于果蔬汁飲料及果酒的榨汁及澄清，對分解果膠具有良好的作用 (6)殼聚糖：

殼聚糖具有提高免疫、活化細胞、預防癌癥、降血脂、降血壓、抗衰老，調節機體環境等作用，可用于醫藥、保健、食品領域。

(7)甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸鉀起到了甜味劑的功效，可以代替蔗糖的使用，有效地控制本發明的含糖量，使本發明適宜高血糖者飲用。

本發明提供的馬齒莧功能飲料采用低溫、生物提取技術，在配方中添加葉酸和維生素C抗氧化成分，與原有的不飽和脂肪酸結合形成新的絡合產物，能較好地保留馬齒莧的有效成分。

由于各個原料之間合理配比，協同作用，使本發明具有良好的增強免疫力、抗衰老作用且具有良好的口感。

上述馬齒莧功能飲料的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、馬齒莧預處理：

稱取新鮮的馬齒莧，洗凈、瀝干，得到經預處理的馬齒莧。

步驟二、浸提：

將所述經預處理的馬齒莧與水混合，進行煎煮處理，瀝干，得到煎煮后的馬齒莧。

本步驟的目的主要是為了破壞馬齒莧植物表皮纖維，提高制漿率。

步驟三、生化處理：

向所述煎煮后的馬齒莧加入純凈水，進行制漿處理，得到漿液；再向漿液中加入果膠酶、殼聚糖進行酶解處理，得到酶解漿液。

本步驟的目的為：

一是為了使馬齒莧纖維酶化分解，充分提取其中的有效成分，二是提高酶解速度，殼聚糖在其中起到了輔助、催化作用，三是使產品質量更加穩定。

步驟四、過濾澄清：

將所述酶解漿液進行過濾、澄清處理得到清液。

步驟五、調配：

向所述清液中加入葉酸、維生素C、檸檬酸、甜味劑和/或糖、純凈水，得到調配液，即為所述馬齒莧功能飲料。

步驟六、成品：

將所述調配液灌裝密封，再經殺菌、冷卻、檢驗和成品出廠步驟，得到成品。

上述馬齒莧功能飲料的制備方法，作為一種優選實施方式，所述浸提步驟中的所述煎煮處理中，所述馬齒莧與水的重量比為1：

(8～12)(比如1：8、1:8.5、1：9、1：9.5、1：10.5、1：11.5)；更優選地，所述馬齒莧與水的重量比為1：

10。

上述馬齒莧功能飲料的制備方法，作為一種優選實施方式，所述浸提步驟中的所述煎煮處理中，溫度均為50-70℃(比如52℃、55℃、58℃、62℃、65℃、68℃)，時間均為20-40min(比如22min、25min、28min、32min、35min、38min)；更優選地，所述煎煮處理中，溫度為60℃，時間為30min。

上述馬齒莧功能飲料的制備方法，作為一種優選實施方式，所述生化處理步驟中，所述制漿處理中，加入所述煎煮后的馬齒莧中的純凈水的質量為純凈水總質量的0.01-0.8(比如為0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.5、0.75、0.8，優選為0.667。

上述馬齒莧功能飲料的制備方法，作為一種優選實施方式，所述生化處理步驟中的酶解處理的時間為6-12h(比如6.2h、6.5h、7.5h、8.5h、9.5h、、10.5h、11.5h、11.8h)；更優選地，所述酶解處理時間為8h。

上述馬齒莧功能飲料的制備方法，作為一種優選實施方式，所述過濾澄清步驟中先將所述酶解漿液過濾得到第一部分清液后，還用純凈水洗凈濾餅得到第二部分清洗液，將所述第一部分清洗液與所述第二部分清液混合，以進行下一步驟；上述用于清洗濾餅的純凈水的質量為純凈水總質量的0.0002-0.02(比如為0.0002、0.0003、0.001、0.005、0.01、0.0105，優選為0.01667)。

相比現有技術，本發明的有益效果為：

1、本發明選用具有增強免疫力、抗衰老功能的馬齒莧、葉酸和維生素C作為原料，使本發明具有良好的增強免疫力、抗衰老效果。

2、本發明的浸提步驟中，采用較低的蒸煮溫度，在生化處理步驟中，采用果膠酶、殼聚糖進行酶解，屬于生物提取技術；另外本發明在配方中添加葉酸和維生素C抗氧化成分，與馬齒莧中原有的不飽和脂肪酸結合形成新的絡合產物，克服了現有技術中有效成分流失的問題，增加了增強免疫力、抗衰老的功能。

3、本專利方法克服了現有技術的不足，在增加了葉酸、維生素C等關鍵功能成分的同時，抗氧化、耐腐蝕、穩定性大大提高，保質期可以達到10個月以上。

4、本發明的由于各個原料之間合理配比，協同作用，使本發明具有增強免疫力、抗衰老的效果，且具有良好的口感。

具體實施方式 以下實施例對本發明的內容做進一步的詳細說明，本發明的保護范圍包含但不限于下述各實施例。

下述原料的選材應該符合國家標準或商業行業標準的規定。

實施例1 本實施例的馬齒莧功能飲料，包括以下原料：

本實施例的馬齒莧功能飲料的制備方法包括以下步驟：

(1)馬齒莧預處理步驟：

按照上述配比稱取新鮮馬齒莧，洗凈、瀝干，得到經預處理的馬齒莧。

(2)浸提步驟：

將該經預處理的馬齒莧與800g純凈水混合，在60℃下進行煎煮30分鐘，瀝干，得到煎煮后的馬齒莧。

(3)生化處理步驟：

向該煎煮后的馬齒莧中加入2000g的純凈水，制漿后得到漿液；再向該漿液中按照上述配比加入果膠酶、殼聚糖進行酶解處理，酶解8小時，得到酶解漿液。

(4)過濾澄清步驟：

將該酶解漿液過濾后取清液；然后用50g純凈水洗凈濾餅得清液，合并后得清液250毫升。

(5)調配步驟：

向該清液中按照上述配比加入葉酸、維生素C、檸檬酸、甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸鉀，還有純凈水150g，得到調配液(即為馬齒莧功能飲料)。

(6)成品步驟：

將該濃縮液灌裝密封，再經紫外線殺菌、冷卻、檢驗和成品出廠步驟，得到成品。

本實施例的馬齒莧功能飲料的保質期為12個月。

本實施例的馬齒莧功能飲料的實驗數據如下。

(1)抗衰老作用實驗：

通過建立D-半乳糖小鼠衰老模型，驗證本實施例的馬齒莧功能飲料的抗衰老作用。

①實驗動物分組、造模和處理 昆明種小鼠，體重28-32g。

將60只小鼠隨機分為6組，每組10只(雌雄各5只)：

空白組、模型組、陽性組和馬齒莧功能飲料組。

空白組：

灌胃等體積生理鹽水； 模型組：

頸背部皮下注射D-半乳糖120mg/kg和灌胃等體積生理鹽水； 陽性組：

頸背部皮下注射D-半乳糖120mg/kg和灌胃等體積香菇菌多糖100mg/kg； 馬齒莧功能飲料組：

頸背部皮下注射D-半乳糖120mg/kg和灌胃200mg/kg上述步驟(5)制備得到的馬齒莧功能飲料。

上述均為連續給藥30天。

②觀察指標與方法、統計方法 A、小鼠胸腺和脾臟指數的測定：

末次給藥24h后，稱小鼠體重，眼眶取血后處死小鼠，取胸腺、脾臟、肝臟和腦組織并稱重，分別測定相關指標。

按“胸腺(mg)/體質量(g)、脾臟(mg)/體質量(g)”計算胸腺指數和脾臟指數。

B、小鼠血MDA含量及SOD活力測定：

將小鼠血液立即離心取其血清，按丙二醛試劑盒說明書操作，于532nm處測定各管吸光度，計算血清中丙二醛含量。

按超氧化物歧化酶試劑盒說明書操作。

于550nm處測定各管吸光度，計算血清中超氧化物歧化酶活力。

C、小鼠肝組織GSH-Px活力測定：

取小鼠肝臟，剔去結締組織，勻漿器研磨、加預冷的生理鹽水制備成10％的組織勻漿。

冷凍離心(2-4℃)，取其上清液，用谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒測定谷胱甘肽過氧化物酶活力。

D、小鼠腦組織CAT活力測定：

取小鼠腦組織，加預冷的生理鹽水進行勻漿制備成10％的組織勻漿。

冷凍離心(2-4℃)，取其上清液，用過氧化氫酶試劑盒測定過氧化氫酶活力。

統計學方法：

實驗數據用均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 15.0軟件系統進行分析，組間比較采用方差分析。

③結果 A、與空白對照組比較，模型組胸腺指數和脾臟指數均有顯著性降低(PB、與空白對照組比較，模型組MDA含量有顯著性升高，SOD、GSH-Px、CAT活力有顯著性降低(P本實施例的馬齒莧功能飲料具有良好的抗衰老作用。

(2)增強免疫力作用實驗：

為了檢驗本實施例的馬齒莧功能飲料的增強免疫力的效果，進行了動物實驗。

實驗方法：

擇雌性小鼠100只，體重18-22g，分成2組，每組50只；其中，試驗組：

在鼠糧和水的基礎上，每天上午喂食200mg/kg上述步驟(5)制備得到的馬齒莧功能飲料；對照組：

僅提供鼠糧和飲水。

連續喂食30天后，分別進行小鼠溶血空斑試驗，小鼠腹腔內巨噬細胞吞噬雞紅蛋白試驗，ConA誘導的小鼠細胞脾淋巴細胞增值能力試驗。

結果為：

相比較對照組，試驗組的小鼠溶血空斑數增加，吞噬雞紅細胞的吞噬百分率和吞噬指數均升高，ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力均增加，且均具有顯著差異。

本實施例的馬齒莧功能飲料具有良好的增強免疫力作用。

實施例2 本實施例的馬齒莧功能飲料，包括以下原料：

本實施例的馬齒莧功能飲料的制備方法包括以下步驟：

(1)馬齒莧預處理步驟：

按照上述配比稱取新鮮馬齒莧，洗凈、瀝干，得到經預處理的馬齒莧。

(2)浸提步驟：

將該經預處理的馬齒莧與800g純凈水混合，在60℃下進行煎煮30分鐘，瀝干，得到煎煮后的馬齒莧。

(3)生化處理步驟：

向該煎煮后的馬齒莧中加入2000g的純凈水，制漿后得到漿液；再向該漿液中按照上述配比加入果膠酶、殼聚糖進行酶解處理，酶解8小時，得到酶解漿液。

(4)過濾澄清步驟：

將該酶解漿液過濾后取清液；然后用50g純凈水洗凈濾餅得清液，合并后得清液250毫升。

(5)調配步驟：

向該清液中按照上述配比加入葉酸、維生素C、檸檬酸、甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸鉀、蔗糖，還有純凈水150g，得到調配液(即為馬齒莧功能飲料)。

(6)成品步驟：

將該濃縮液灌裝密封，再經紫外線殺菌、冷卻、檢驗和成品出廠步驟，得到成品。

本實施例的馬齒莧功能飲料的保質期為12個月。

按照實施例1的實驗方法對本實施例步驟(5)制備得到的馬齒莧功能飲料進行抗衰老作用實驗和增強免疫力作用試驗，可以證明本實施例的馬齒莧功能飲料具有良好的抗衰老作用和增強免疫力作用。

實施例3 本實施例的馬齒莧功能飲料，包括以下原料：

本實施例的馬齒莧功能飲料的制備方法包括以下步驟：

(1)馬齒莧預處理步驟：

按照上述配比稱取新鮮馬齒莧，洗凈、瀝干，得到經預處理的馬齒莧。

(2)浸提步驟：

將該經預處理的馬齒莧與900g純凈水混合，在50℃下進行煎煮20分鐘，瀝干，得到煎煮后的馬齒莧。

(3)生化處理步驟：

向該煎煮后的馬齒莧中加入4000g的純凈水，制漿后得到漿液；再向該漿液中按照上述配比加入果膠酶、殼聚糖進行酶解處理，酶解7小時，得到酶解漿液。

(4)過濾澄清步驟：

將該酶解漿液過濾后取清液；然后用70g純凈水洗凈濾餅得清液，合并后得清液350毫升。

(5)調配步驟：

向該清液中按照上述配比加入葉酸、維生素C、檸檬酸，還有純凈水25030g，得到調配液(即為馬齒莧功能飲料)。

(6)成品步驟：

將該濃縮液灌裝密封，再經紫外線殺菌、冷卻、檢驗和成品出廠步驟，得到成品。

本實施例的馬齒莧功能飲料的保質期為12個月。

按照實施例1的實驗方法對本實施例步驟(5)制備得到的馬齒莧功能飲料進行抗衰老作用實驗和增強免疫力作用試驗，可以證明本實施例的馬齒莧功能飲料具有良好的抗衰老作用和增強免疫力作用。

實施例4 本實施例的馬齒莧功能飲料，包括以下原料：

本實施例的馬齒莧功能飲料的制備方法包括以下步驟：

(1)馬齒莧預處理步驟：

按照上述配比稱取新鮮馬齒莧，洗凈、瀝干，得到經預處理的馬齒莧。

(2)浸提步驟：

將該經預處理的馬齒莧與1000g純凈水混合，在50℃下進行煎煮20分鐘，瀝干，得到煎煮后的馬齒莧。

(3)生化處理步驟：

向該煎煮后的馬齒莧中加入4000g的純凈水，制漿后得到漿液；再向該漿液中按照上述配比加入果膠酶、殼聚糖進行酶解處理，酶解7小時，得到酶解漿液。

(4)過濾澄清步驟：

將該酶解漿液過濾后取清液；然后用70g純凈水洗凈濾餅得清液，合并后得清液350毫升。

(5)調配步驟：

向該清液中按照上述配比加入葉酸、維生素C、檸檬酸，還有純凈水94930g，得到調配液(即為馬齒莧功能飲料)。

(6)成品步驟：

將該濃縮液灌裝密封，再經紫外線殺菌、冷卻、檢驗和成品出廠步驟，得到成品。

本實施例的馬齒莧功能飲料的保質期為12個月。

按照實施例1的實驗方法對本實施例步驟(5)制備得到的馬齒莧功能飲料進行抗衰老作用實驗和增強免疫力作用試驗，可以證明本實施例的馬齒莧功能飲料具有良好的抗衰老作用和增強免疫力作用。

實施例5 本實施例的馬齒莧功能飲料，包括以下原料：

本實施例的馬齒莧功能飲料的制備方法包括以下步驟：

(1)馬齒莧預處理步驟：

按照上述配比稱取新鮮馬齒莧，洗凈、瀝干，得到經預處理的馬齒莧。

(2)浸提步驟：

將該經預處理的馬齒莧與1200g純凈水混合，在70℃下進行煎煮40分鐘，瀝干，得到煎煮后的馬齒莧。

(3)生化處理步驟：

向該煎煮后的馬齒莧中加入3000g的純凈水，制漿后得到漿液；再向該漿液中按照上述配比加入果膠酶、殼聚糖進行酶解處理，酶解7小時，得到酶解漿液。

(4)過濾澄清步驟：

將該酶解漿液過濾后取清液；然后用80g純凈水洗凈濾餅得清液，合并后得清液400毫升。

(5)調配步驟：

向該清液中按照上述配比加入葉酸、維生素C、檸檬酸，還有純凈水295720g，得到調配液(即為馬齒莧功能飲料)。

(6)成品步驟：

將該濃縮液灌裝密封，再經紫外線殺菌、冷卻、檢驗和成品出廠步驟，得到成品。

本實施例的馬齒莧功能飲料的保質期為12個月。

馬齒莧功能飲料專利，馬齒莧中化合物Oleraciamide E及其提取分離方法與應用專利檢索

馬齒莧中化合物Oleraciamide E及其提取分離方法與應用 申請號 CN201910266938.0 申請日 2019-04-03 公開(公告)號 CN109897077A 公開(公告)日 2019-06-18 申請人 遼寧中醫藥大學； 發明人 英錫相； 劉錫龍； 張文潔； 徐紋； 顧瑩瑩； 段陽； 摘要 本 發明 涉及中藥提取、分離領域，尤其涉及從 馬 齒莧藥材中提取、分離和 鑒別 出的新化合物及其提取分離方法與應用，具體為一種馬齒莧中化合物Oleraciamide？E及其提取分離方法與應用。

所述新化合物的提取分離方法依次采用 水 煎煮提取、乙酸乙酯萃取、大孔 樹脂 柱層析、 硅 膠柱層析、ODS中壓柱及Sephadex？LH-20純化、液相分離制備，其結構采用UV、IR、HR-ESI-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR及二維核磁波譜解析的方法確定為一種新 生物 堿 類化合物。

該化合物具有潛在的抗炎和抗 腫瘤 作用等活性，新化合物及其鹽或衍生物可以作為其他化合物合成先導物，以及新藥開發和藥理活性研究的原料，為開發新藥和開發新成分提供先導物和理論依據。

權利要求 1。馬齒莧中化合物？Oleraciamide？E？，分子式為C22H25NO10，

2。如權利要求1所述的馬齒莧中化合物？Oleraciamide？E？的提取分離方法，其特征在于，具體步驟為：

步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液過濾，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備用；步驟2、將步驟1中濃縮液用乙酸乙酯反復萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物；步驟3、將步驟2中乙酸乙酯萃取物經大孔樹脂柱分離，采用乙醇-水梯度洗脫，30%乙醇部分蒸干后上硅膠柱，依次采用乙醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位經減壓濃縮至干，備用；步驟4、將步驟3中所得物再經預處理的ODS柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅膠填料）層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，將顯色的洗脫部位減壓濃縮至干，得濃縮物備用；步驟5、將步驟4中所得濃縮物經預處理的Sephadex？LH-20（羥丙基葡聚糖凝膠），以甲醇等度洗脫，經薄層色譜進行檢測，顯色，將顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得濃縮物備用；步驟6、對步驟5中所得濃縮物進行HPLC(高效液相)分離制備，以甲醇和0.1%甲酸體積比為27：

73作為流動相，制備得到一個新生物堿類化合物。

3。如權利要求2所述提取分離方法，其特征在于，所述步驟1中水煎煮提取兩次，每次煎煮2小時，水用量為藥材的10倍。

4。如權利要求2所述的提取分離方法，其特征在于，所述ODS和Sephadex？LH-20凝膠的預處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

5。如權利要求2所述的提取分離方法，其特征在于，所述步驟2中濃縮液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯與濃縮液的體積比為1：1。

6。如權利要求2所述的提取分離方法，其特征在于，所述步驟3中所用乙酸乙酯，及乙酸乙酯和甲醇的體積比為5：1、2：1、1：2、1：4和注水的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫。

7。如權利要求2所述的提取分離方法，其特征在于，所述步驟4中所用甲醇-水梯度洗脫中甲醇和水的體積比為40：60，60：40和100：0。

8。如權利要求1所述的馬齒莧中化合物？Oleraciamide？E？用于制備抗炎和抗腫瘤作用的藥物。

說明書全文 [0001] 本發明涉及中藥提取、分離領域，尤其涉及從馬齒莧藥材中提取、分離和鑒別出的新化合物及其提取分離方法，具體為一種馬齒莧中化合物Oleraciamide？E及其提取分離方法與應用。

[0002] 馬齒莧（Portulaca？oleracea？L。），又名長命菜、馬莧菜，為馬齒莧科植物。

馬齒莧耐旱耐澇，且耐光耐陰，分布廣泛，資源豐富，作為藥食兩用的野生植物備受關注，2015版《中華人民共和國藥典》中收載馬齒莧的干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血止血、止痢等功效，用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲咬傷、便血、痔血、崩漏下血等。

[0003] 馬齒莧現代藥理學研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、調節免疫功能等作用。

研究表明馬齒莧眾多化學成分為其多樣的藥理作用提供了物質基礎，馬齒莧主要化學成分包括黃酮類、香豆素、萜類、甾類、生物堿、氨基酸、各種色素類和礦物質類等。

其中生物堿是馬齒莧中一類主要的化學成分，目前已報道的生物堿類成分有去甲腎上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二環己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；還有環二肽生物堿和酰胺類生物堿：

馬齒莧酰胺A-？S。

[0004] 目前從馬齒莧中分離出的化學成分大多數是已知的，且結構新穎性較低，因此，對馬齒莧中新化合物的開發和分離是亟待需要的。

[0005] 針對上述問題，本發明提供一種Oleraciamide？E及其提取分離方法，具體為從馬齒莧中提取的新化合物，經研究發現本發明的新化合物具有抗炎、抗腫瘤的作用，同時提供一種針對本發明新化合物的簡便、快速、環保、純度高的提取分離方法。

[0006] 為實現上述目的，本發明提供以下技術方案。

[0007] 馬齒莧中化合物？Oleraciamide？E？，分子式為C22H25NO10，化學結構式為：

。

[0008] ？一種馬齒莧中化合物？Oleraciamide？E？的提取分離方法，具體步驟為。

[0009] 步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液過濾，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備用。

[0010] 步驟2、將步驟1中濃縮液用乙酸乙酯反復萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

[0011] 步驟3、將步驟2中乙酸乙酯萃取物經大孔樹脂柱分離，采用乙醇-水梯度洗脫，30%乙醇部分蒸干后上硅膠柱，依次采用乙醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位經減壓濃縮至干，備用。

[0012] 步驟4、將步驟3中所得物再經預處理的ODS柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅膠填料）層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，將顯色的洗脫部位減壓濃縮至干，得濃縮物備用。

[0013] 步驟5、將步驟4中所得濃縮物經預處理的Sephadex？LH-20（羥丙基葡聚糖凝膠），以甲醇等度洗脫，經薄層色譜進行檢測，顯色，將顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得濃縮物備用。

[0014] 步驟6、對步驟5中所得濃縮物進行HPLC(高效液相)分離制備，以甲醇和0.1%甲酸體積比為27：

73作為流動相，制備，最終得到本發明所述新化合物。

[0015] 所述ODS的預處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

[0016] 與現有技術相比本發明的有益效果。

[0017] 本發明中所述馬齒莧新化合物的分離和藥理活性研究未被現有論文期刊所報道；本發明提供來源于馬齒莧的新化合物及一種針對本發明新化合物的提取分離方法，采用水 煎煮提取、乙酸乙酯萃取、大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析、ODS中壓柱、Sephadex？LH-20及HPLC進行分離純化與制備，成功提取分離出新的化合物，該方法操作步驟僅為七步，操作方法簡便及快速，提取分離過程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工藝方法環保，且經該方法分離得到的化合物純度較高，均大于90%，此外經研究表明以上化合物具有抗炎、抗腫瘤作用，因此本發明新化合物及其鹽和衍生物可以作為其他化合物合成先導物，以及新藥開發 和藥理活性研究的原料，亦可用于制備抗炎、抗腫瘤作用的藥物。

[0018] 附圖說明：


實施例。

 本發明提供新化合物，分子式為C22H25NO10，命名為Oleraciamide？E，化學結構式為：


所述新化合物根據結構命名為Oleraciamide？E，表1為該新化合物的核磁數據：

1H-NMR與13C-NMR在DMSO中。

本發明新化合物的核磁數據。

Oleraciamide E：

黃綠色粉末，易溶于甲醇，微溶于氯仿。

點樣于硅膠薄層板后，噴碘化鉍鉀試液斑點顯橘黃色，提示該化合物為生物堿成分。



將步驟1中所得藥液部分蒸干后經硅膠柱層析分離，用乙酸乙酯等度洗脫，其中硅膠為100-200目，40℃以下減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。

步驟3：

將步驟2中乙酸乙酯提取物經大孔樹脂柱分離，采用乙醇-水（0/100，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v）梯度洗脫，30%乙醇部分90-100℃下蒸干后經硅膠柱層析分離，其中硅膠為200～300目，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇（5：1、2：1、1：2、1：4，v：v）及注水的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，共得到18個部位（即共得到18個瓶，每瓶400mL），經薄層色譜進行檢測，顯色，合并顯色的1～5洗脫部位，將合并后的1～5部位經40℃以下減壓濃縮至干，備用。


將步驟3中所得物再經預處理的ODS中壓柱層析分離，其中填料粒度為20～40μm，用甲醇-水（40/60，60/40，100/0，v/v）梯度洗脫（加壓，使流速為1mL/min，溫度為室溫），得到10個部位（即梯度洗脫得10個瓶，每瓶200mL），經薄層色譜進行檢測，顯色，將顯色的1～4部位保留，50℃以下減壓濃縮至干，備用。

所述ODS的預處理過程為甲醇浸泡過24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

 步驟5：

將步驟4中所得顯色部位經預處理的Sephadex？LH-20柱層析，以甲醇等度洗脫，得到30個部位（即梯度洗脫得30個瓶，每瓶20mL），經薄層色譜進行檢測，顯色，將顯色的10～15部位合并，50℃以下減壓濃縮至干，備用。

所述Sephadex？LH-20凝膠的預處理過程為甲醇浸泡過24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。

[0041] 步驟6：

將步驟5中所得顯色部位經HPLC分離制備，以甲醇和0.1%甲酸體積比為27：

73作為流動相，檢測波長為230，280nm，分離制備得到本發明新生物堿化合物，歸一法測定純度均為90～99%。

[0042] 本發明新化合物的抗炎作用。

[0043] 1、主要材料。

[0044] 1.1、藥品和試劑：

實驗所用新生物堿化合物由上述方法制備，純度為90～99%，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。

DMEM高糖培養基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素（杭州四季青公司）；LPS（美國Sigma公司）；IL-6、TNF-α、PGE2的ELISA試劑盒（美國Cayman公司）；細胞裂解液、Griess試劑（碧云天生物技術有限公司）。

[0045] 1.2？細胞株：

RAW264.7巨噬細胞（美國ATCC細胞庫）。

[0046] 1.3？分組：

分為對照組、LPS組和實驗組，各一組。

[0047] 2？實驗方法。

[0048] 2.1？細胞培養，DMEM高糖培養基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL？青霉素和100μg/mL？鏈霉素)，置于37.5%，CO2培養箱中培養。

[0049] 2.2？MTT比色法測定細胞活力，上述三組分別取對數生長期RAW264.7巨噬細胞接種于96孔培養板中，細胞密度為1×104個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5%CO2條件下培養過夜后，實驗組加入不同濃度的本發明新化合物？Oleraciamide？E（1-100μM），孵育1h后向LPS組和實驗組分別加入終濃度為1μg/mL的LPS，另設調零組（含DMSO溶媒的培養液），每組設3個復孔，考察加入藥物后對細胞的影響。

上述各組細胞培養24h后，在各孔細胞中加入5？mg/mL？MTT？20μL，溫度37℃，5%CO2條件下繼續孵育4h后，終止培養，吸棄孔內液體，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使細胞內結晶充分溶解，酶標儀570nm波長處測定各孔吸光值。

[0050] 2.3？利用格里斯（Griess）法測定NO的含量，考察本發明新化合物對LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO產生量的抑制作用。

小鼠巨噬細胞RAW264.7傳代后在含10%胎牛 血清的高糖細胞培養基DMEM中培養，實驗組加入不同濃度的本發明新化合物Oleraciamide？E（1-50μM），在37℃，5%CO2條件下孵育1h后用LPS（終濃度為1μg/mL）誘導炎癥反應，24h后收集上清液，每組處理重復3孔。

Griess法測定細胞上清液中NO的含量，根據不同濃度本發明新化合物對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的影響，用以反映NO水平。

[0051] 2.4？ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-α和炎癥介質PGE2：

將對數生長期RAW264.7巨噬細胞接種于24孔培養板中，細胞密度為1×105個/mL，每孔1mL，溫度37℃，5%？CO2條件下培養過夜，實驗組加入本發明新生物堿化合物Oleraciamide？E（1-50μM），培育1h后，在每孔加入LPS（終濃度為1μg/mL），共孵育24h，每組處理重復3孔。

ELISA法測定馬齒莧來源新生物堿化合物處理后的RAW264.7巨噬細胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2的含量。

[0052] 3實驗結果。

[0053] 實驗結果表明本發明特殊化合物對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7的增殖無影響，安全無毒；并可有效抑制LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7所產生過量炎癥細胞因子IL-6、TNF-α和炎癥介質NO、PGE2，且呈濃度依賴。

[0054] 細胞相對存活率實驗結果如表2所示。

[0055] 表2？本發明對RAW264.7巨噬細胞相對存活率的影響。

[0056] 注：

*P[0057] 表3？本發明對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的影響（均數±標準差，n=3）。

[0058] 注：

*P[0059] ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-α和炎癥介質PGE2結果如表4所示。

[0060] 表4：

本發明對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2含量的影響（均數±標準差，n=3）。

[0061] 注：

*P[0062] 本發明新生物堿化合物的抗腫瘤作用。

[0063] 1？主要材料。

[0064] 1.1？藥品和試劑：

實驗所用新生物堿化合物由上述方法制備，純度為90～99%，精密稱取，用DMSO稀釋至下述各劑量組所需溶液。

DMEM高糖培養基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素（杭州四季青公司）。

[0065] 1.2？細胞株：

人結腸癌細胞Caco-2、人乳腺癌細胞MCF-7、人胃癌細胞BGC-823、人肺腺癌細胞SPC-A1、人肝癌細胞BEL-7402、人宮頸癌細胞Hela-229、卵巢癌細胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細胞KB（中科院上海細胞庫）。

[0066] 1.3？分組：

分為對照組、實驗組和調零組(含DMSO溶媒的培養液)。

[0067] 2？實驗方法。

[0068] 2.1？細胞培養，DMEM高糖培養基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100？U/mL？青霉素和100？μg/mL？鏈霉素)，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

[0069] 2.2？MTI法檢測細胞增殖，取對數生長期細胞接種于96孔培養板中，細胞密度為1×104個/mL，每孔100μL，溫度37℃，5%CO2條件下培養過夜后，實驗組加入不同濃度的本發明新生物堿化合物，每組設3個復孔，加藥后置于37℃，5%CO2培養箱中培養48h。

將含藥培養液吸去，加入體積比為4：

1的無血清培養液和MTT（終質量濃度為5？mg／mL)共100mL，繼續孵育 4h，小心吸去上清液后，每孔加入？DMSO？150μL，放于震蕩器上震蕩以使結晶完全溶解 （5min），酶標儀在570nm波長下檢測各孔的吸光度（A）值。

然后，計算各濃度化合物對細胞生長的抑制率，？抑制率公式：

細胞生長抑制率=(1-A加藥孔／A對照孔)×100％，再應用SPSS軟件處理數據，將抑制率對藥物濃度作曲線，計算IC50值。

[0070] 3？實驗結果。

[0071] 實驗結果表明本發明新生物堿化合物對人結腸癌細胞Caco-2、人乳腺癌細胞MCF-7、人胃癌細胞BGC-823、人肺腺癌細胞SPC-A1、人肝癌細胞BEL-7402、人宮頸癌細胞Hela- 229、卵巢癌細胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細胞KB、的增殖具有抑制作用，且隨藥物濃度增大，抑制率也明顯升高，即呈濃度依賴。

本發明兩種新化合物對上述八種腫瘤細胞IC50值見表5。

[0072] 表5？本發明對腫瘤細胞的抑制作用。

[0073] 綜上所述，本發明提供新生物堿化合物及其提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析、ODS中壓柱層析、Sephadex？LH-20柱層析及HPLC分離制備，成功的分離得到一種新化合物，該方法簡便，快速，環保，且經該方法分離得到的化合物純度較高，由于所得化合物化學結構獨特，從常用中藥馬齒莧中提取出來，其具有抗炎和抗腫瘤作用，因此本發明新生物堿化合物及其鹽和衍生物可以作為天然產物開發中藥新藥，具有廣闊的前景。

 

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