今天，樂知網小編 給大家分享 輪狀病毒檢測試劑盒專利，輪狀病毒抗原檢測試劑注冊技術

輪狀病毒檢測試劑盒專利，新型冠狀病毒檢測試劑盒原理及相關專利申請現狀分析 ？

冠狀病毒病（Coronavirus disease 2019，COVID-19），是一種由嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型引發的傳染病，目前世界各國對該病致死率（CFR）的估計值差異甚大，截止2021年2月8日，多數國家該病的觀測致死率在0.5%~5.0%之間，全球初步修正病死率約為2.9% [1]。

隨著新型冠狀病毒（以下也簡稱新冠）疫情的出現，全世界各國都積極與病毒展開斗爭。

在疫情防控斗爭中，精準、快速地檢測病毒是阻隔疫情擴散的重要手段之一。

我國體外診斷企業組織精干力量進行科研攻關，加上藥監部門專設綠色審批通道，一大批新型冠狀病毒檢測試劑盒成功上市，為抗擊疫情做出了突出貢獻。

截至目前，通過藥監局注冊上市的新型冠狀病毒檢測試劑盒達到72個（以注冊證編號計）[2]。

接下來本文將介紹不同原理的新型冠狀病毒的檢測試劑盒以及與新型冠狀病毒檢測試劑盒相關的專利申請現狀。

檢測試劑盒的分類與原理 表1：

各類型新型冠狀病毒檢測試劑盒特點[3] 核酸檢測試劑盒 目前，我國批準上市的核酸檢測試劑盒共36個[2]，核酸檢測方法主要包括PCR法、恒溫擴增法、測序法、CRISPR檢測法等，目前還研發出基因芯片技術。

第二代PCR技術（熒光PCR）是病毒檢測方法的主流方法，也是目前我國批準上市的核酸檢測試劑盒采用最多的技術。


DNA聚合酶鏈式反應（PCR原理）[4] 抗體檢測試劑盒 抗體法基本原理是抗原抗體結合，目前我國已經有4個抗體檢測試劑盒上市[2]，包括上轉發光免疫層析法、磁微粒化學發光法和膠體金法。

其中，膠體金法由于使用方便且可用肉眼直接觀察結果，是本次新冠抗體法檢測試劑盒采用的主要技術。


膠體金法與磁微粒化學發光法對比[5] 圖3：

免疫應答一般規律[5] 病毒感染人體后，身體的免疫系統會自動反應，產生相應的特異性抗體（IgM、IgG）抵抗病毒。

理論上，IgM抗體產生略早。

但消失也快；IgG抗體在IgM抗體產生后出現，但維持時間更長。

若是采樣時間過早，抗體還未產生或者產生量少，便會造成所謂的“漏檢”，因此，建議檢測新冠抗體時，對IgM抗體和IgG抗體進行聯合檢測[5]。

抗原檢測試劑盒 2022年3月10日，國家衛健委組織制定并發布了《新冠病毒抗原檢測應用方案（試行）》，在核酸檢測基礎上增加抗原檢測作為補充，最大的好處是能實現受檢人群的快速自測。

目前，我國已經有32個抗原檢測試劑盒上市[2]，采用技術主要為熒光免疫層析法、乳膠法和膠體金法等。

抗原檢測所需時間短，可用于疑似病例的快速篩查。

但抗原檢測靈敏度低，不能單獨用于新型冠狀病毒感染的診斷，應結合核酸檢測、影像檢測以及病史、接觸史判斷感染狀態。

檢測試劑盒的專利申請現狀 截止2022年6月10日，利用Incopat數據通過關鍵詞檢索發現，與新冠相關的試劑盒的中國專利數量申請號合并后共計1437件（包括僅提及試劑盒，主要是蛋白及其序列、制備方法的改進相關申請）。

輪狀病毒檢測試劑盒專利，輪狀病毒六種檢測技術分析

 一、輪狀病毒 (rotavirus，RV）是引起嬰幼兒及各種幼齡動物非細菌型腹瀉的主要病原體 ， 由澳大利亞科學家 Bishop 于1973 年首次在嚴重腹瀉的嬰兒胃腸道內發現。

該病毒由于外觀酷似車輪而得名。

輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，成熟的病毒顆粒直徑約為 70-75nm，由 3 層二十面體蛋白衣殼組成，最里層的核衣殼中包裹著病毒的基因組——11 個不連續雙鏈 rNa。

根據其內層衣殼蛋白 (viral protein，VP)-6 的組特異性抗原表位，輪狀病毒可分為 a~G 等 7 個群，它們通過感染小腸上皮細胞，從而造成細胞損傷，引起腹瀉。

其中感染人、牛和豬的是 a、B 和 C 群輪狀病毒，a 群輪狀病毒是引起嬰幼兒重癥腹瀉的主要原因 ， 是科學工作者研究的重點。

根據 1986-2000 年輪狀病毒性腹瀉病例統計，全世界每年因輪狀病毒感染導致的 5 歲以下低齡兒童腹瀉病例約有 1.11 億，約 2500萬例患兒需要尋醫就診，200 萬人需要住院治療，其中死亡人數高達352，000-592，000 人 ( 如圖 1)，且病患人數逐年增加。

據調查，在撒哈拉以南的非洲和亞洲地區，超過三分之一的嬰幼兒腹瀉及胃腸炎疾病是由輪狀病毒引起的，每年導致 50 萬到 60 萬嬰幼兒死亡。

歐洲和美國預防和治療該類疾病的直接和間接的醫療費用高達數 10 億美元。

在我國，0 ～ 2 歲以內的嬰幼兒人數約為 4000 萬人（含新生兒），每年大約有 1000 萬嬰幼兒患輪狀病毒感染性胃腸炎，占嬰幼兒人數的1/4。

因此，能夠快速有效地診斷輪狀病毒性腹瀉是醫學界的重要課題。

輪狀病毒廣泛存在于自然界，耐熱，耐酸堿，結構穩定，傳染性很強，潛伏期 3 天左右，一般經糞一口途徑傳播 ( 也可通過呼吸道傳播 )，病人和隱性帶毒者均可為傳染源。

秋季是輪狀病毒性腹瀉的高發期。

在我國，每年的 10 月至次年的2月均有一個嬰幼兒腹瀉的發病高峰，病原學研究證實，這些病例的 40%~60% 都是由輪狀病毒引起的。

嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉病程一般可持續3至9天，感染發病初期表現為流涕、咳嗽、發熱、咽部疼痛等感冒癥狀，每日腹瀉次數在數次至數十次不等，且伴有嘔吐、腹痛，因此容易被誤診為胃腸型感冒。

因此對輪狀病毒感染的正確檢出在疾病治療中顯得非常重要。

輪狀病毒隨帶毒者糞便排出體外，通過糞一口途徑感染病人后，在患兒的十二指腸粘膜細胞中增殖，引起十二指腸粘膜表面絨毛變短鈍，十二指腸表皮細胞內二糖酶減少，從而影響患兒腸道對鹽類、糖類和水分的正常吸收，造成腹瀉。

有報道指出輪狀病毒感染十二指腸上皮細胞后，還能夠通過胃腸屏障進入血液，引起輪狀病毒血癥，造成呼吸系統、中樞神經系統、其他消化器官以及循環系統的損害，導致患兒引起肺炎、中毒性心肌炎等嚴重并發癥，更甚者還可合并腦炎、肺炎、腸出血、腸套疊或病毒性心肌炎而危及生命。

輪狀病毒腸道外多器官的感染并發癥已成為導致患兒死亡的重要原因之一。

盡管有一些藥物可緩解輪狀病毒感染引起的臨床癥狀，但目前還沒有治療輪狀病毒感染的特效藥物。

由于目前的防治措施還不十分有效，因此發展快速、準確、早期的 rV 檢測方法，對于防止輪狀病毒暴發流行，早期診斷，早期治療等具有重要意義。


輪狀病毒主要的測定方法 輪狀病毒的預防監測需要快速準確的診斷技術支持。

用于輪狀病毒的檢測技術包括直接血凝技術、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術、電鏡技術、基因檢測技術、酶聯免疫技術和膠體金技術等。

1、直接血凝技術 用輪狀病毒抗體致敏血球的檢測方法，主要從唾液、糞便等分泌物中檢測輪狀病毒。

該方法的結果不易重復，需要有經驗的技術人員。

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術 RV基因組由 11 個雙鏈 rNa 片段組成，可以通過提取糞便中病毒rNa，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳形成獨特 11 條區帶，來判斷是否感染輪狀病毒。

rNa 電泳圖譜，既有診斷價值，又可區別不同型病毒感染，但是 rNa 提取較難成功且操作繁瑣耗時。

3、電鏡技術 在大便中用電鏡直接檢出特殊形態的輪狀病毒顆粒，敏感性較高，是鑒定輪狀病毒的經典方法。

但由于病毒顆粒易于降解常常影響正確診斷，并且電鏡設備昂貴，難以普及，故電鏡技術的應用大大受到限制，一般只能用于研究。

4、基因檢測技術 PCR技術是核酸分子定性和定量檢測的最常用方法，為輪狀病毒等難培養的病毒的診斷及病毒學研究提供了一個有力的手段。

熒光定量PCR雖然操作復雜、需要專門培訓的技術人員、特殊的儀器設備，但其特異性強、靈敏度高、定量準確，在病原學診斷方面具有很高的應用價值。

5、酶聯免疫吸附試驗技術 酶聯免疫吸附檢測（ELISA）是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。

操作簡便，靈敏度和特異度高，可檢測 105 ～ 106 個病毒顆粒／ g 的糞便樣本。

1985年被 WHO 推薦作為輪狀病毒的標準檢測手段。

一般使用的是 ELISA雙抗體夾心法，該方法可根據不同檢測目的設計特異的包被抗體和標記抗體；不僅用于診斷，還可進行血清分型、毒株鑒別等，適用于大規模臨床檢測和流行病學調查。

但由于糞便標本成分復雜，如果腹瀉標本含較多的油脂和懸浮物，無法離心干凈，易形成非特異性凝集物，可能干擾抗原和抗體的特異性結合，從而導致結果判斷錯誤。

6、膠體金技術 該技術是納米膠體金與免疫學技術結合所產生的快速診斷產品。

該方法以膠體金作為示蹤標志物，通過滲濾或層析提高抗原抗體反應的效率，形成的紅色膠體金條帶肉眼即可辨別，也可用灰度儀測量。

經過 30 多年的發展現在已相當成熟，在 HIV、HCV、HBV、流感病毒等傳染病診斷，HCG、LH 等生殖激素檢測，毒品和藥物依賴鑒定，以及農業、環保等領域都有著廣泛應用。

輪狀病毒檢測試劑盒專利，輪狀病毒抗原檢測試劑注冊技術

 病毒等微生世界在近兩年逐漸成為醫學診斷行業的熱點之一，國家藥監局近期配套出臺了多個體外診斷試劑注冊技術指導原則。

2021年4月15日，總局發布《輪狀病毒抗原檢測試劑注冊技術審查指導原則（2021年第24號）》，詳見正文 輪狀病毒抗原檢測試劑注冊技術審查 指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對輪狀病毒抗原檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評申報資料提供參考。

本指導原則是對輪狀病毒抗原檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需闡述理由及相應的科學依據。

同時應根據產品的具體特性對研究內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他合理方法也可以采用，并應提供詳細的研究資料和驗證資料。

應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍 輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬。

輪狀病毒顆粒為球形，直徑70～75nm，負染后在電鏡下觀察，病毒外形呈車輪狀。

輪狀病毒基因組總長約18kb，由11個節段的雙股RNA組成，分別編碼6個結構蛋白（VP1～4，VP6和VP7）和5-6個非結構蛋白（NSP1～NSP5/6）。

根據內層衣殼蛋白VP6的血清型，目前主要將輪狀病毒分為A～G群。

已知A、B、C群輪狀病毒可致人類急性胃腸炎，其中A群輪狀病毒最為常見，是引起嬰幼兒急性腸胃炎的主要病原體之一。

B群輪狀病毒可在兒童和成人中暴發流行。

C群輪狀病毒的發病率相對較低。

輪狀病毒根據VP6蛋白的兩個抗原決定簇可分為4個亞群（Ⅰ，Ⅱ，Ⅰ＋Ⅱ，非Ⅰ非Ⅱ）。

根據VP7和VP4表達中和抗原的不同，又可分為多個血清型或基因型。

VP7蛋白是糖基化的蛋白，決定G的血清型。

VP4是蛋白酶敏感蛋白，決定P的血清型/基因型。

目前世界范圍內流行的A群輪狀病毒主要為G1、G2、G3、G4、G9、G12等血清型，P分型主要為P[4]、P[8]和P[6]等基因型。

我國常見的A群輪狀病毒型別主要為G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]、G2P[4]等。

輪狀病毒可污染食物、水和環境等，主要通過糞-口途徑傳播。

輪狀病毒感染的典型癥狀為嘔吐、腹痛、腹瀉，部分伴發熱，嚴重脫水和/或電解質紊亂者可能會出現休克、昏迷甚至死亡。

本指導原則適用于以抗原抗體反應為原理，對人糞便樣本或其他適用樣本中的輪狀病毒進行體外定性檢測的試劑，臨床用于急性胃腸炎患者輪狀病毒感染的輔助診斷。

對于采用其他檢測方法的試劑，有利之處可參照執行。

本指導原則適用于進行產品注冊和相關許可事項變更的產品。

其他未盡事宜應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料 主要包括臨床適應癥背景情況、產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他內容。

其中，產品描述應明確試劑盒可檢測的輪狀病毒具體群組；其他內容包括同類產品在國內外批準上市的情況，應著重從檢驗方法及臨床適用范圍等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。

綜述資料應符合《辦法》和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號，以下簡稱《公告》）的相關要求。

（二）主要原材料的研究資料 主要原材料包括抗原、抗體、質控品、參考品等。

應提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質量標準等相關研究資料。

如主要原材料為企業自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：

選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供應商提供的質量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料，供應商應固定，不得隨意更換。

申請人應對各主要原材料均明確質量控制標準。

1。特異性抗原、抗體 病原體特異的抗原、抗體是該類產品的關鍵原材料。

對于抗原，如為天然抗原應明確來源，如為重組抗原應明確相應的核酸或者蛋白序列信息。

應詳述抗體所針對的抗原表位和抗體制備所用的免疫原，提交確定該抗體作為主要原材料的依據，還應提交抗體來源、制備、篩選、鑒定及質量標準（外觀、蛋白濃度、純度、分子量、效價、功能性試驗等）等詳細試驗資料。

2。其他主要原材料 除上述主要原材料外，產品中包含的其他主要原材料，如其他抗體、膠體金、硝酸纖維素膜、微孔板、樣本稀釋液等，均應進行選擇及驗證，并提交相關資料。

明確主要原材料的供應商和質量控制標準。

3。試劑盒質控品/質控線 產品應設置合理的質控品/質控線。

質控品（如適用）應至少包含陰性和陽性兩個水平。

陽性質控品可選擇滅活的病毒株或臨床陽性樣本，陰性質控品可選擇臨床陰性樣本等。

提交質控品/質控線相關原料的來源、選擇和性能確認等相關研究資料，明確供應商和質量控制標準。

企業應對質控品/質控線的檢測結果做出明確的范圍要求（試驗有效性的判斷）。

4。企業參考品 應提交企業參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度/滴度確認方法或試劑等相關驗證資料。

企業參考品的基質應與實際樣本相同。

陽性參考品應至少包括所有常見型別的病毒株或臨床陽性樣本，并設置不同滴度水平。

A組輪狀病毒型別應至少包括G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]和G2P[4]等。

陰性參考品應考慮檢測特異性的評價，應納入正常臨床樣本、含干擾因素的樣本及其他病原體特異性抗原陽性樣本。

檢測限參考品可設置病毒株/臨床陽性樣本的系列梯度樣本，其中應包含檢測限附近水平。

A組輪狀病毒型別應至少包括G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]和G2P[4]等。

精密度參考品一般包括弱陽性水平、中/強陽性水平。

（二）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1。產品基本反應原理介紹。

2。主要生產工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產工藝的確定依據。

3。包被/標記工藝研究，申請人應考慮如包被/標記液量、濃度、時間、條件等指標對產品性能的影響，通過實驗確定上述指標的最佳組合。

4。顯色系統、酶作用底物等的介紹以及最適條件研究。

5。反應條件確定：

申請人應考慮反應時間、判讀時間、反應溫度、洗滌液體積和洗滌次數（如涉及）等條件對產品性能的影響，通過實驗確定上述條件的最佳組合。

6。反應體系中樣品加樣方式及加樣量確定：

通過實驗確定最佳的加樣方式及加樣量。

如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，申請人還應對樣本稀釋液及其用量、其他必要的處理方法等進行研究。

（三）分析性能評估

申請人應提交對試劑盒的全部性能進行評估的資料，對于每項分析性能的評價都應包括研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資料。

有關分析性能評估的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、人員及數量、適用儀器、儀器掃描模式、試劑規格、批號、臨床樣本來源（如涉及）等。

分析性能評估的實驗方法可以參考相關文件或指導原則進行。

建議著重對以下適用分析性能進行研究：

1。樣本采集和處理 研究對保存液成分、濃度和使用量的要求；具體采樣量和采樣方式的要求；樣本運輸和保存要求等。

2。最低檢測限 2.1最低檢測限的確定 在進行最低檢測限研究時，應先進行檢測限范圍的初步確認。

最低檢測限的確定試驗建議采用梯度稀釋的病毒、每個梯度的病毒液重復3-5份、每份重復檢測不少于20次，通常將具有90%-95%以上陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測限。

建議采用蝕斑形成單位（plaque forming units，PFU）或半數組織培養感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）法進行病毒滴度的滴定，并采用上述兩種方式作為病毒濃度的表示方式。

2.2最低檢測限的驗證 應在最低檢測限水平附近，選擇不同來源的病毒株進行最低檢測限的驗證。

最低檢測限的驗證應包含輪狀病毒所有常見型別（至少包括G9P[8]、G3P[8]、G1P[8]、G2P[4]等，以及近年來我國流行的型別）。

試驗采用的稀釋液應與適用樣本類型的性質一致。

應提供詳細的病毒滴度的確定方法，同時應詳細描述病毒樣本的確認方法及驗證結果。

3。包容性 申請人應使用輪狀病毒所有常見型別的多個病毒株，進行包容性的驗證，以考察試劑對不同病毒株的檢出能力。

可從最低檢出限、重復性、準確性等方面進行驗證，提供樣本相關信息及病毒濃度的確認方法、實驗數據。

4。精密度 應對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，包括檢測時間、分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素。

設定合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

用于精密度評價的臨床樣本應至少包含3個水平：

陰性樣本、臨界陽性樣本、（中或強）陽性樣本，并根據產品特性設定適當的精密度要求。

5。特異性 5.1交叉反應 用于交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：

抗原結構的同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位可能存在的其他微生物。

建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。

申請人應提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。




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